激光扫描共焦显微镜的结构特点

2005/3/18/14:52    激光扫描共焦显微镜由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。常用计算机为奔腾系列，内存最好是64MB，以便于图像的存取和运算，软件界面多数为Windows或Windows NT，后者图象采集效率更高，软件也可在互联网上方便地更新。

    1 显微镜光学系统

    显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。通常有倒置和正置两种形式，前者在活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。显微镜光路以无限远光学系统为佳，可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色 差物镜为好，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。多功能显微镜以德国的蔡司Zeiss和莱卡Leica的产品为好，也常用日本的尼康Nikon或奥林巴斯Olympus产品。

2 扫描装置

    LSCM使用的扫描装置有两类，台扫描系统和镜扫描系统。现在也有两者结合使用的仪器。台扫描通过步进马达驱动载物台，位移精度可达0.lμm，能够有效地消除成象点横向象差，使样品信号强度不受探测位置的影响，可准确定位定量地扫描检测视野中每一物点的光强度，缺点是载物台机械移动、图象采集速度较慢。镜扫描有双镜扫描和单镜扫描两种，通转镜完成对样品的扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定，但因光路略有偏转会对通光效率和象差有所影响。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。

3 激光光源

    LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。氪氩离子激光器是可见光范围内使用的多光谱激光，发射波长488nm、568nm和647nm分别为蓝光、绿光和红光，大功率氩离子激光器是紫外和可见光混合激光器，发射波长为351－364nm、488nm和514nm分别为紫外光、蓝光和绿光，单个激光优点是安装方便，光路简单，但价格较贵并存在不同激光之间的光谱竞争和色差校正问题。多激光器系统在可见光范围使用氩离子激光器，发射波长为 488nm和514nm的蓝绿光，氦氖激光器发射波长为633nm的红光，紫外光选用氩离子激光器，波长为351－364nm。其优点是各谱线激光单独发射，不存在谱线竞争的干扰，调节方便，但光路复杂，光学系统共轴准直调试要求高。1996年新型双光子激光器问世，利用双光子倍频效应，使用可见光激光来代替紫外激光作激发光源达到检测紫外探针的目的。双光子激光能使活体细胞荧光损伤减少，成象质量改善，增强对样品深层的观察能力。通过计算机控制的声光调制器可进行各波长光谱之间高速切换以及迅速改变激光光斑、强度和照明时间。
 
4 检测系统

    LSCM为多通道荧光采集系统，光路上要求至少有三个荧光通道和一个透射光通道，如有第四荧光通道更好，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。每个PMT前设置单独的针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要。通过在线视频打印机或数字照相机可以实时拷贝图象和制作幻灯。